Topmusicanswers
Felsökning av PCR- och RT-PCR-förstärkning
| Problem | Möjlig orsak |
|---|---|
| Inga band på gelén | Förlängningstiden var för kort |
| Termisk cykler hade inte rätt temperatur | |
| Extra, ospecifika band på gel | Primers hybridiserade till en sekundär plats på mallen |
| DNA -kontaminering infördes i primers eller buffertar |
- Vad orsakar PCR -fel?
- Hur felsöker du ett PCR -problem?
- Vad skulle du göra om PCR -förstärkningen av ett prov misslyckades?
- Vad händer när du lägger till för mycket primer till PCR?
Vad orsakar PCR -fel?
Vanligtvis är det första forskare gör att skylla på ett defekt enzym eller reagens när ett experiment misslyckas, men med PCR är det faktiskt mindre sannolikt att det är orsaken till misslyckande. Oftare är djupare interna problem som primer -design, termocyklerparametrar eller ospecifik bindning till andra mallsekvenser orsaken.
Hur felsöker du ett PCR -problem?
Kontrollera amplifieringslängdskapaciteten hos de valda DNA -polymeraserna. Använd DNA -polymeraser speciellt utformade för lång PCR. Välj DNA -polymeraser med hög processivitet, som kan förstärka långa mål på kortare tid. Minska glödgnings- och förlängningstemperaturerna för att hjälpa primerbindning och enzymtermostabilitet.
Vad skulle du göra om PCR -förstärkningen av ett prov misslyckades?
Om en amplifieringsreaktion misslyckas och du misstänker att DNA -mallen är förorenad med en hämmare, lägg till det misstänkta DNA -preparatet till en kontrollreaktion med en DNA -mall och primerpar som har förstärkts väl tidigare .
Vad händer när du lägger till för mycket primer till PCR?
Användningen av högre koncentrationer av primers kan ha följande effekter: Om primrarna kan bilda dimerer, leder höjningen av deras koncentration endast till att primer-dimerer skapas och inte förbättrar amplifieringen av den önskade PCR-produkten.
